Abstract
Serine proteasen zijn een subgroep van de protease familie die betrokken is bij verschillende fysiologische processen, waaronder de immuunrespons, celdood en weefselgenezing. De opregulatie van deze proteasen kan leiden tot een toename van ontstekingsbevorderende cytokines, degradatie van extracellulaire matrix componenten, activering van PAR2 of MMP-9.
We hebben eerder een in vivo proof of concept bekomen met een multi-target serine protease inhibitor (UAMC-00050) in droge ogen ziekte. Lokale toediening van deze stof in het oog van een traan-deficiënt droge ogen ratmodel verminderde zowel weefselschade als ontstekingsparameters. Bovendien veroorzaakte UAMC-00050 ook een vermindering van de viscerale overgevoeligheid in een ratmodel van post-inflammatoire viscerale overgevoeligheid. Daarom stelden wij de hypothese voorop dat serine proteasen een essentiële rol spelen in zowel droge ogen ziekte als prikkelbare darm syndroom (PDS).
De focus van dit project ligt op het karakteriseren van de proteasen die betrokken zijn bij droge ziekte en IBS. We maken gebruik van activiteitsgebaseerde protein profilering (ABPP), een proteomic techniek waarbij chemische probes worden gebruikt voor doelwitidentificatie en geneesmiddelenonderzoek. Activiteitsgebaseerde probes (ABPs) zijn kleine moleculen die covalent reageren met het actief centrum van het enzym en die het labelen van doeleiwitten vergemakkelijken.
Tot op heden werd een reeks van 17 nieuwe ABPs, analogen van onze remmer UAMC-00050, gesynthetiseerd. De uitdagende synthese van ABPs heeft een uitgebreide optimalisatie vereist op vlak van chemische synthese. De fosfonaatgroep is van cruciaal belang om trypsine-achtige serineproteasen irreversibel te binden. Alle ABPs werden biochemisch gekarakteriseerd door bepaling van de IC50 waarde in een panel van verschillende serine proteasen die betrokken zijn bij immuunreacties. Tot dusver zijn verscheidene krachtige ABPs gesynthetiseerd en gekarakteriseerd.
Aangezien ABPs zich covalent moeten binden aan het doeleiwit, zal nu getracht worden het kinetisch profiel van de meest krachtige probes te analyseren met progressiecurve-analyses. Bovendien zullen sprongverdunningsexperimenten worden uitgevoerd om onderscheid te maken tussen remmingsmechanismen.
In een laatste fase zullen ABPs die actief blijken te zijn tegen interessante serine proteasen en die een irreversibel inhibitiemechanisme ondergaan, gebruikt worden om opgereguleerde proteasen in biologische stalen van droge ogen en IBS patiënten te labelen en te identificeren. Massaspectrometrie en gel electroforese zullen gebruikt worden om de ABPs op te sporen. De identificatie van de opgereguleerde proteasen zal het ontwerp en de synthese mogelijk maken van meer selectieve en krachtige verbindingen voor de behandeling van droge ogen en IBS.
Onderzoeker(s)
Onderzoeksgroep(en)
Project type(s)