Onderzoek Dirk Snyders

Abstract

Het Brugada syndroom (BrS) is een erfelijke hartritmestoornis die tot plotse hartdood kan leiden. BrS is verantwoordelijk voor 12% van de gevallen van plotse hartdood, vaak op jonge leeftijd (< 40 jaar oud). Screening met huidige diagnostische genen panels kan slechts in circa 30% procent van de BrS patiënten de ziekteveroorzakende genetische mutatie identificeren. Desondanks worden met deze testen vaak genetische varianten met onbekende betekenis (VUS) gevonden. Helaas is er een gebrek aan functionele studiemodellen die kunnen voorspellen of een VUS ziekteveroorzakend is. Daarom zal ik in mijn project twee "proof-of-concept" modellen ontwikkelen voor een gekende ziekteveroorzakende BrS mutatie in het CACNA1C gen: een hartspiercel model uit humane stamcellen en een vooruitstrevend transgeen zebravismodel met fluorescente indicatoren in het hart. Door deze functioneel te karakteriseren met innovatieve elektrofysiologische en beeldvormingstechnieken, kan ik op celniveau en in het volledig hart het effect van deze mutatie en zijn bijdrage tot de ziekte analyseren. Na deze validatie zal ik dezelfde strategie toepassen om het functionele effect van twee VUSsen, geïdentificeerd in twee BrS patiënten, te achterhalen. Deze vernieuwende studiemodellen en technieken zullen het mogelijk maken om accuraat te voorspellen of een VUS ziekteveroorzakend is, waardoor artsen meer specifieke risicoanalyse en preventie strategieën zullen kunnen toepassen voor hartritmestoornissen in de toekomst.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Loeys Bart
• Co-promotor: Alaerts Maaike
• Co-promotor: Knapen Dries
• Co-promotor: Labro Alain
• Co-promotor: Schepers Dorien
• Co-promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Vandendriessche Bert

Onderzoeksgroep(en)

• Medische Genetica (MEDGEN)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project voorziet een upgrade van de huidige elektrofysiologie technologieën aan de Universiteit Antwerpen door de aankoop van een state-of-the-art Multi-Electrode Array (MEA) platform. Patch-clamping is de huidige gouden standaard voor de studie van de elektrofysiologie van exciteerbare cellen maar is een uiterst arbeidsintensieve en invasieve techniek, die slechts korte termijn metingen van individuele cellen toelaat. MEAs daarentegen voorzien high-throughput, niet-invasieve, longitudinale metingen van functionele cel-netwerken zonder verstoring van belangrijke cel-cel contacten en onderzoeken dus een fysiologisch meer relevant model. Bovendien laat het multiwell aspect toe dat er verschillende celculturen onder verschillende condities onderzocht kunnen worden. Dit geeft ook de opportuniteit om "drug library" screeningen uit te voeren. Gebaseerd op deze voordelen, zijn MEA platformen uitermate geschikt voor de pathomechanistische studie van neurologische en cardiovasculaire aandoeningen door middel van specifieke assays voor het bestuderen van (1) cardiale activiteit: meting van veld- en actiepotentialen van (iPSC-)hartspiercellen voor studie van de vorm, conductie en aritmie; (2) neuronale activiteit met belangrijke parameters: actiepotentiaal activiteitsgraad, synchroniciteit als maat voor synaps-sterkte, oscillatie voor karakterisatie van de neuronale organisatie; (3) (iPSC)-vasculaire gladde spier contractiliteit op basis van impedantie-veranderingen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Loeys Bart
• Co-promotor: Kooy Frank
• Co-promotor: Labro Alain
• Co-promotor: Ponsaerts Peter
• Co-promotor: Rademakers Rosa
• Co-promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Timmerman Vincent
• Co-promotor: Weckhuysen Sarah

Onderzoeksgroep(en)

• Medische Genetica (MEDGEN)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

"Inherited Cardiac Arrhythmia" (ICA) vormt een groep van genetische aandoeningen waarbij de patiënten abnormale en potentieel dodelijke ritmestoornissen vertonen. Deze episoden zijn dikwijls niet-symptomatisch, maar kunnen tot bewustzijnsverlies en plotse dood leiden. Momenteel zijn meer dan 50 ICA-genen gekend. Met de 'next generation sequencing' technologie is het nu mogelijk om al deze genen simultaan in meerdere ICA patienten te analyseren. Deze methode identificeert duidelijke ziekteverwekkende genafwijkingen. Daartegenover staat dat het stijgend aantal betrokken genen (wegens beter mechanistisch inzicht in 'modifier' genen en polymorfismen) ons confronteert met een toenemend aantal genetische varianten waarvan de causaliteit onduidelijk is (variants of unknown significance, VUS); dit vormt een nieuwe uitdaging voor behandeling van de ICA patiënten. Het doel van dit project is een 'tool' te ontwikkelen die toelaat de functionele impact van deze VUS te bepalen. Wij zullen een zebravis model ontwikkelen waarin de electrische activiteit van het hart gedetecteerd wordt via van fluorescente signalen. Vermits de zebravis doorzichtig is tijdens de vroege ontwikkelling, laat deze methode toe om de activiteit 'in vivo' te observeren met exceptionele resolutie. Na validatie van deze tool met gekende pathogene mutaties, zullen we de method toepassen op het toenemend aantal VUS. Deze nieuwe aanpak zal de clinici toelaten een specifiek gepersonaliseerde geneeskunde aan te bieden.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Labro Alain
• Co-promotor: Schepers Dorien

Onderzoeksgroep(en)

• Experimentele Neurobiologie Groep (ENU)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Het venoom van Conus slakken kan beschouwd worden als een onderbenutte cocktail van biologisch actieve stoffen, die meer een meer erkend worden als bron van peptide therapeutica. Conus slakken zijn gespecialiseerde predatoren die de meest gesofistikeerd peptide chemie en neuropharmacologie ontwikkeld hebben voor hun eigen biologische doelen (bv. prooi verlammen). Hun gifmengsel bevat een uitgebreide set van structureel en functioneel diverse neurotoxines. Deze neurotoxine of conotoxines zijn kleine peptides (rijk aan cysteines) die zeer selectieve liganden zijn van ionen kanalen of receptoren. De structuur en functie van gamma- en omega-conopeptides (QSARs) zullen onderzocht worden met site-directed mutagenesis van zowel het toxine als het doelwit (caridale ionen kanalen) om de onderliggende moleculaire mechanism op te helderen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

• Experimentele Neurobiologie Groep (ENU)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Hartritmestoornissen zijn het gevolg van ongecontroleerde elektrische signalen in het hart die tot 33.8 miljoen mensen treft wereldwijd en 1-3% van de Belgische bevolking. Bovendien wordt verwacht dat het aantal patiënten met atriale fibrillatie zal verdubbelen in de komende 20 jaar, de klinische en economische impact van deze ziekte is dus groot. Het doel van dit project is tweevoudig: (1) Het tot stand brengen van een nieuwe en innovatieve tool voor de synchrone stimulatie van cardiomyocyten met behulp van licht en waarbij genetische manipulatie overbodig is en (2) Een 'proof of concept' behalen alsook een initieel protocol voor een veiliger alternatief voor RF/cry ballon katheter ablatie. Beide objectieven zullen verwezenlijkt worden met behulp van een goud nanopartikel label, specifiek voor een cardiomyociet oppervlakte merker. De goud nanopartikels absorberen LASER/LED light en produceren warmte. Naargelang de snelheid in temperatuurstijging kan ofwel fotothermische stimulatie ofwel fotothermische ablatie geïnduceerd worden.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Labro Alain
• Co-promotor: Saenen Johan
• Co-promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Coonen Laura

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Overerfbare cardiale aritmieën (ICA), zoals lange QT syndroom (LQTS) en Brugada syndroom (BrS), zijn een groep van overerfbare aandoeningen waarbij patiënten een onregelmatig hartritme hebben (zogenaamde hartritmestoornissen). Deze zijn het gevolg van verstoorde elektrische dynamieken in het hart. Deze perioden kunnen onopgemerkt voorbij gaan maar kunnen ook leiden tot plotse cardiale dood. Tot op heden zijn er meer dan 50 genen beschreven die ICA kunnen veroorzaken. Dankzij de komst van de next generation sequeneringstechnologie is het mogelijk om al deze genen tegelijkertijd te testen in verschillende ICA patiënten in één experiment. Enerzijds laat dit ons toe om pathogene genetische veranderingen te identificeren, maar anderzijds heeft dit ons ook geconfronteerd met het feit dat het genoom een groot aantal genetische veranderingen bevat waarvoor het onzeker is of ze bijdragen tot het phenotype of niet (zogenaamde "varianten met ongekende betekenis"). Om deze reden is er een hoge nood aan een fysiologisch relevant functionele tool om de pathogeniteit van deze varianten te testen. Door twee state-of-the-art technieken te combineren, namelijk genetisch gecodeerde voltage indicatoren (GEVI) en enkel vlak verlichting microscopie (SPIM), hebben we een nieuwe tool ontwikkeld die ons toelaat om het cardiale conductiesysteem en zijn anatomische connectiviteit te bestuderen in zebravis aan een ongeziene resolutie. Door de elektrische signalen in het zebravishart om te zetten naar fluorescente signalen, zal ik aan de hand van deze tool actiepotentialen optisch kunnen mappen zowel in het volledige hart als op het niveau van de individuele cel. Dit laat me toe om de cardiale conductiesnelheid te bepalen en vertragingen in conductie op te sporen, wat dit een nieuwe en uiterst geschikte tool maakt om de elektro- en pathofysiologische mechanismen te onderzoeken van twee aritmie gerelateerde syndromen, LQTS en BrS. Uiteindelijk zal deze functionele test aangewend worden om de pathogeniteit te bepalen van genetische varianten met ongekende klinische betekenis en de mogelijk arrhytmogene bijwerkingen van geneesmiddelen te testen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Knapen Dries
• Mandaathouder: Schepers Dorien

Onderzoeksgroep(en)

• Experimentele Neurobiologie Groep (ENU)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Erfelijke hartritmestoornissen (ICA) zijn een groep van voornamelijk autosomaal dominante aandoeningen die gekenmerkt worden door een verstoorde actiepotentiaal in het hart die kan leiden tot plotse dood op jonge leeftijd. Hoewel er momenteel al meer dan 50 genen geassocieerd werden met ICA, blijft de precieze genetische oorzaak ongekend in ongeveer 70% van de patiënten. Bovendien zijn deze erfelijke hartritmestoornissen genetisch en fenotypisch heterogeen en in een moleculair diagnostische setting worden veel varianten met onzekere pathogene betekenis gedetecteerd. Dit belemmert een juiste risico inschatting en daarmee ook efficiënte preventief en therapeutisch beleid van de patiënt. In een unieke interfacultaire samenwerking tussen het Centrum Medische Genetica, het Departement Cardiologie, het Laboratorium voor Experimentele Hematologie en het Laboratorium voor Moleculaire Biofysica, Fysiologie en Farmacologie, beogen wij deze noden aan te pakken in een project met twee hoofddoeleinden: de identificatie van nieuwe causale genen voor ICA en de ontwikkeling van een diagnostische tool die toelaat het effect van genetische varianten functioneel fenotypisch te karakteriseren. Het eerste doel zal bereikt worden aan de hand van koppelingsstudies en genoomsequenering in klinisch goed gekarakteriseerde maar genetisch onopgeloste families. Genidentificatie wordt gevolgd door functionele karakterisatie van de kandidaat-varianten. Het tweede doel zal gerealiseerd worden door middel van de constructie en elektrofysiologische karakterisatie van heterologe expressiesystemen en cardiomyocyten gedifferentieerd uit patiënt specifieke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-CM). Als een proof-of-principle zullen we vertrekken van fibroblasten van familieleden met dezelfde identieke SCN5A founder mutatie maar verschillende fenotypische ernst en nadien zullen we ook SCN5A varianten van onbekende betekenis bestuderen in het iPSC-CM model. Deze weloverwogen aanpak in combinatie met de expertise van de verschillende deelnemende onderzoeksgroepen zal ons zeker in staat stellen om de verwachte doeleinden van dit project te bereiken. Zo kan een genetische diagnose in een groter aantal ICA families gesteld worden en vertaald worden in een gepersonaliseerde functionele interpretatie van het genetische resultaat in patiënten en familieleden. Dit laat toe om een juiste risico inschatting te maken, correcte individuele klinische beslissingen te nemen en preventieve of therapeutische middelen efficiënt te gebruiken.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Loeys Bart
• Co-promotor: Heidbuchel Hein
• Co-promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Abstract (Dutch version) Spanningsafhankelijke K+ (Kv) kanalen zijn K+ selectieve membraan proteïnen die als functie van de membraanpotentiaal hun configuratie wijzingen tussen een open, gesloten en geïnactiveerde toestand. Kv kanalen zijn essentiële componenten in het zenuwstelsel waar ze de membraanrustpotentiaal, repolarisatie fase van de actiepotentiaal (AP) en de vuurfrequentie van neuronen regelen. Vanwege hun essentiële functie in het zenuwstelsel zijn Kv kanalen belangrijke farmacologische targets. Desondanks de grote variëteit aan farmacologische componenten die gekend zijn met Kv kanalen als receptor, blijft het onderliggende werkingsmechanisme vaak onbekend. In dit project onderzoeken we hoe het inactivatie process van Kv kanalen een invloed kan hebben op hun farmacologisch profiel.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Stas Jeroen

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Spanningsafhankelijke K+ (Kv) kanalen spelen een belangrijke rol in de neuronale exiteerbaarheid wat weerspiegeld wordt in verscheidene ernstige ziekten veroorzaakt door Kv disfunctie zoals epilepsie. De Kv2 subfamilie omvat twee leden met vergelijkbare eigenschappen. De diversiteit binnen deze Kv2 subfamilie wordt verhoogd door heterotetramerizatie met leden van de zogeheten silent Kv (KvS) subfamilies (Kv5-Kv6 en Kv8-Kv9). KvS subeenheden vormen zelf geen functionele homotetrameren, maar assembleren met Kv2 subeenheden tot functionele Kv2/KvS heterotetrameren die gewijzigde biofysische eigenschappen vertonen in vergelijking met Kv2.1 homotetrameren. In vergelijking met de wijdverspreide Kv2 subeenheden, vertonen KvS subeenheden een beperkter expressiepatroon wat weefselspecifieke functies voor deze Kv2/KvS kanalen creëert. Hierdoor zijn Kv2/KvS kanalen meer gewenste farmacologische en therapeutische doelwitten dan Kv2 homotetrameren. Om de farmacologische relevantie van Kv2.1/KvS kanalen alsook hun rol in de neuronale fysiologie en ziekten volledig te begrijpen, is het belangrijk om de moleculaire structuur van KvS bevattende kanaal complexen te ontrafelen, hun rol in de neuronale exiteerbaarheid te begrijpen, het mechanisme waarmee KvS subeenheden hun unieke effecten uitoefenen te bepalen en de moleculaire determinanten van kanaalopening van deze KvS bevattende kanalen te ontrafelen. Dit zijn de onderwerpen van deze "postdoc vernieuwing" applicatie.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Bocksteins Elke

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project kadert in een onderzoeksopdracht toegekend door de Universiteit Antwerpen. De promotor levert de Universiteit Antwerpen de onderzoeksresultaten genoemd in de titel van het project onder de voorwaarden zoals vastgelegd door de universiteit.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project betreft fundamenteel kennisgrensverleggend onderzoek gefinancierd door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen. Het project werd betoelaagd na selectie door het bevoegde FWO-expertpanel.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Stas Jeroen

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project kadert in een onderzoeksopdracht tussen enerzijds UA en anderzijds Instituut Born Bunge. UA levert aan Instituut Born Bunge de onderzoeksresultaten genoemd in de titel van het project onder de voorwaarden zoals vastgelegd in voorliggend contract.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

De algemene doelstelling van dit project is om nieuwe inzichten te verkrijgen in de moleculaire aspecten van de interacties in stille Kv (KvS) subeenheden en tussen KvS en Kv2.1 subeenheden. Hiervoor worden verschillende complementaire technieken om eiwit-eiwit interacties, subcellulaire distributie en biofysische kanaal eigenschappen te bestuderen, gebruikt. Verder willen we de fysiologische rol van Kv2/KvS heterotetramere kanalen bepalen, met behulp van een transgeen model systeem. Omdat Kv6.4 duidelijk waarneembare veranderingen in de biofysische parameters induceert en alle constructen alsook het transgene model systeem (gerichte deletie van Kv6.4) voor Kv6.4 aanwezig zijn in het laboratorium wordt Kv6.4 gebruikt als primair test model. Drie specifieke doelstellingen worden voorgesteld: 1) Bepaling van het moleculaire mechanisme waarmee Kv6.4 de Kv2.1 "gating" beïnvloedt in heterotetramere Kv2.1/Kv6.4 kanalen. 2) Identificatie van de moleculaire determinanten die verantwoordelijk zijn voor het stille gedrag van Kv6.4. 3) Transgene analyse van de fysiologische rol van Kv6.4.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Bocksteins Elke

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project betreft fundamenteel kennisgrensverleggend onderzoek gefinancierd door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen. Het project werd betoelaagd na selectie door het bevoegde FWO-expertpanel.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project betreft fundamenteel kennisgrensverleggend onderzoek gefinancierd door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen. Het project werd betoelaagd na selectie door het bevoegde FWO-expertpanel.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Kv kanalen zijn transmembranaire proteïnen die een ion geleidende porie vormen welke actief opent of sluit onder invloed van een veranderende membraan potentiaal. Deze proteïnen vervullen een belangrijke rol in tal van fysiologische processen zoals oa. de regulatie van de cardiale actiepotentiaal. Phosphoinositide phosphatidylinositol,4,5-biophosphate (PIP2) is een modulator van Kv kanalen en met dit project wordt het werkingsmechanisme van PIP2 modulatie onderzocht. Vermits verscheidene ziekten hun oorzaak kennen in verworven of congenitale modificaties van Kv kanalen is het moleculair inzicht in de diverse regulatiemechanismen belangrijk voor het begrijpen en behandelen van dergelijke ziekten.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Met dit project (samenwerking met prof. Jan Tytgat, KUL) willen we een betere kennis verwerven over de werking van biologische toxines. Dankzij deze toxines zal ook een beter inzicht worden verkregen in de structuur, functie en farmacologie van K+ kanalen. Finaal streven we naar het vinden van toxines die een belangrijke therapeutische en/of fysiologische waarde zullen hebben. In eerste instantie zullen venomen/toxines elektrofysiologisch gescreened worden op alle beschikbare K+ kanalen. Toxines die een hit geven zullen verder worden opgezuiverd en gekarakteriseerd (1). Interessante toxines die innovatief zijn of kunnen leiden tot toepassingen zullen onderworpen worden aan een structuur-functie analyse (2). 1) Het effect van de toxines zal elektrofysiologisch worden nagegaan met behulp van de voltage-clamp techniek. Uit de analyse van de gemeten K+ stromen wordt het mechanisme (permeatieblok of effect op gating) bepaald en de blokkeringparameters (affiniteit, kinetica-effecten, spanningsafhankelijkheid) verkregen. Interessante toxines zullen onderworpen worden aan een structuur-functie analyse. 2) Het eerste deel van de structuur-functie analyse omvat de mutagenese van potentiële bindingsplaatsen in het kanaal om de specifieke bindingssite van het toxine te achterhalen d.m.v. verschillende farmacologische blokkeringsparameters. Eenmaal de bindingsplaats gekarakteriseerd is kan de betreffende sequentie vergeleken worden met die van andere kanalen waardoor nieuwe potentiële kandidaten kunnen worden gedetecteerd. Het tweede deel van de structuur-functie analyse is de mutagenese van de toxinesequentie waaruit de functionele aminozuren zullen worden bepaald. Bepaling van energetische koppeling tussen aminozuren aan het interactie-oppervlak van de toxine en het kanaal zal gebeuren d.m.v. "mutant cycle analysis".

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Kopljar Ivan

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

De algemene doelstelling van dit project kadert in de identificatie van ionenkanalen als targets van deze nieuwe toxines. De specificiteit van de interactie maakt het tevens mogelijk om deze toxines te gebruiken om een structuur-functie analyse uit te voeren op deze ionenkanalen en toxines. Specifieke doelstellingen: 1. Het biologisch target van k-hefutoxin1 2A. Structuur-functie analyse van kanalen met een hoge bindingsaffiniteit voor k-hefutoxin1 2B. Structuur-functie analyse van het k-Hefutoxin1 3. Biologische targets en structuur-functie analyse van nieuwe toxines

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Specifieke doelstellingen 1. Ophelderen van het dynamisch gedrag tijdens kanaal gating m.b.v. FRET in combinatie met voltage-clamp. 2. Interageren de S1 en S5 domeinen van Kv2.1 met elkaar? 3. Welke residuen in de S6 C-terminus van KCNQ1 zijn relevant voor het gating mechanisme van het kanaal? 4. De KIKER sequentie moduleert gating door landingsinteracties.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Raes Adam

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Met dit project beogen we een beter inzicht te krijgen in de gating van Kv kanalen waarbij we gebruik maken van Kv1.5 (vormt homotetrameren zoals Shaker), Kv2.1 (vormt zelf hometetrameren maar ook heterotrameren met "silent" subeenheden) en Kv6.3 (prototype voor de "silent" subeenheden omdat de Kv2.1-Kv6.3 kanalen duidelijk herkenbare functionele verschillen t.o.v. Kv2.1 kanalen vertonen). Hierbij maken we gebruik van puntmutaties en chimere constructen gecombineerd met patch clamp en dynamische FRET metingen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Met dit project (samenwerking met prof. Jan Tytgat, KUL) willen we een betere kennis verwerven over de werking van biologische toxines. Dankzij deze toxines zal ook een beter inzicht worden verkregen in de structuur, functie en farmacologie van K+ kanalen. Finaal streven we naar het vinden van toxines die een belangrijke therapeutische en/of fysiologische waarde zullen hebben. In eerste instantie zullen venomen/toxines elektrofysiologisch gescreened worden op alle beschikbare K+ kanalen. Toxines die een hit geven zullen verder worden opgezuiverd en gekarakteriseerd (1). Interessante toxines die innovatief zijn of kunnen leiden tot toepassingen zullen onderworpen worden aan een structuur-functie analyse (2). 1) Het effect van de toxines zal elektrofysiologisch worden nagegaan met behulp van de voltage-clamp techniek. Uit de analyse van de gemeten K+ stromen wordt het mechanisme (permeatieblok of effect op gating) bepaald en de blokkeringparameters (affiniteit, kinetica-effecten, spanningsafhankelijkheid) verkregen. Interessante toxines zullen onderworpen worden aan een structuur-functie analyse. 2) Het eerste deel van de structuur-functie analyse omvat de mutagenese van potentiële bindingsplaatsen in het kanaal om de specifieke bindingssite van het toxine te achterhalen d.m.v. verschillende farmacologische blokkeringsparameters. Eenmaal de bindingsplaats gekarakteriseerd is kan de betreffende sequentie vergeleken worden met die van andere kanalen waardoor nieuwe potentiële kandidaten kunnen worden gedetecteerd. Het tweede deel van de structuur-functie analyse is de mutagenese van de toxinesequentie waaruit de functionele aminozuren zullen worden bepaald. Bepaling van energetische koppeling tussen aminozuren aan het interactie-oppervlak van de toxine en het kanaal zal gebeuren d.m.v. "mutant cycle analysis".

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Kopljar Ivan

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Spanningsgevoelige K+ kanalen komen algemeen voor in cellen. Een volledig geassembleerd K+ kanaal is een tetrameer van ¿-subeenheden. Op basis van homologie kunnen spanningsafhankelijke K+ kanalen onderverdeeld worden in verschillende (sub)families. De Kv familie telt 11 subfamilies. Alle tot nu toe gekende "silent" Kv subeenheden vormen functionele heterotetramere kanalen met de Kv2.x subeenheden waarbij ze de biofysische eigenschappen van Kv2 wijzigen. Met yeast-two-hybrid is ook een associatie van de silent Kv6.3, Kv10.1 en Kv11.1 subeenheden met Kv3.1 en Kv5.1 gevonden. Met behulp van elektrofysiologische experimenten zullen we nagaan of deze associaties functioneel aantoonbaar zijn in vivo. Hiernaast zal getracht worden dit moleculair te bevestigen met FRET en co-immunoprecipitatie experimenten. Kv2 subeenheden komen in nagenoeg alle neuronale weefsels voor, terwijl "silent" subeenheden een specifieker expressiepatroon vertonen. Door RT-PCR zal de expressie van "silent" Kv subeenheden in DRG neuronen bepaald worden. De rol van de geïdentificeerde "silent" Kv subeenheden op de elektrische eigenschappen van de DRG neuronen zal met behulp van de patch-clamp techniek nagegaan worden. Dit zal in eerste instantie gebeuren door biofysische parameters zoals kinetica en spanningsafhankelijkheid van de natieve Kv2 stromen te karakteriseren. In de "current clamp" mode zal de rol van de aanwezige silent Kv subeenheden in de actiepotentiaal en de afvuurfrequentie van de DRG neuronen nagegaan worden. Vervolgens zal de functie van de aanwezige "silent" Kv subeenheden bevestigd worden door overexpressie of RNAi. De functie van Kv6.3 zal op een complementaire manier nagegaan worden door een gedragsstudie op Kv6.3 overexpressie muizen uit te voeren en vervolgens de muis DRG neuronen te isoleren en een elektrofysiologische analyse, vergelijkbaar met deze op wild-type DRG neuronen, uit te voeren. Met dit project zal een beter inzicht verkregen worden in de associatie, distributie en fysiologische rol van "silent" Kv subeenheden. De functie van Kv6.3 zal op een complementaire manier nagegaan worden door een gedragsstudie op Kv6.3 overexpressie muizen uit te voeren en vervolgens de muis DRG neuronen te isoleren en een elektrofysiologische analyse, vergelijkbaar met deze op wild-type DRG neuronen, uit te voeren. Met dit project zal een beter inzicht verkregen worden in de associatie, distributie en fysiologische rol van "silent" Kv subeenheden.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Bocksteins Elke

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project kadert in een onderzoeksopdracht tussen enerzijds UA en anderzijds de federale overheid. UA levert aan de federale overheid de onderzoeksresultaten genoemd in de titel van het project onder de voorwaarden zoals vastgelegd in voorliggend contract.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Kopljar Ivan

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

De secretie van insuline in de pancreas is sterk gereguleerd door ionen kanalen. Stijging van de glucose concentratie in het bloed veroorzaakt een depolarisatie van de ¿-cellen in de pancreas, wat uiteindelijk resulteert in de insulinesecretie. De repolarizatie van de ¿-cellen gebeurt voornamelijk door een traag inactiverende K+ stroom, IDR, en resulteert in een inhibitie van de insuline secretie. De IDR wordt in de ¿-cellen voor ~2/3 gedragen door Kv2 bevattende kanalen; voorts verhoogt down-regulatie van Kv2.1 de glucose afhankelijke insuline secretie Er is echter aangetoond dat Kv2 kanalen heterotetrameren vormen met de leden van de Kv5-Kv11 subfamilies; deze laatsten zijn zelf niet in staat stroom te leveren en worden daarom ook wel "silent" subeenheden genoemd. Co-expressie met Kv2.1 resulteert in heterotetramere kanalen met eigenschappen die duidelijk te onderscheiden zijn van homotetramere Kv2.1 stromen. Er is reeds aangetoond dat Kv6.1, Kv6.2, Kv9.2, Kv9.3, Kv10.1 en Kv11.1 tot expressie komen in de pancreas. In dit project zullen we de rol van de "silent" subeenheden in de regulatie van de insuline secretie onderzoeken met behulp van insuline secreterende cellijnen en geisoleerde ß¿cellen. Met behulp van RT-PCR zal systematisch worden nagegaan welke "silent" subeenheden tot expressie komen. Via overexpressie en down-regulatie van deze subeenheden zal het effect op de insuline secretie en op de electrofysiologische eigenschappen van de cel worden nagegaan. We zullen tevens antilichamen aanmaken tegen de "silent" subeenheden om via immunohistochemie de exacte localisatie in de pancreas na te gaan en de interactie met Kv2.1 in vivo te bevestigen. Als laatste zullen transgene muismodellen (overexpressie en knock-out) worden aangemaakt en de werking van de ß¿cellen in deze muizen zal worden bestudeerd.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Ottschytsch Natacha

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

De Transgenese Service Faciliteit (TgSF) is gestructureerd rond meerdere deelaspecten van de transgenese in muis en is werkzaam in het Specifiek Pathogeen Vrije (SPF) gedeelte van het animalarium van de Universiteit Antwerpen - CDE: productie van genetisch gewijzigde muizen via pronucleaire injectie, productie van knock-out en knock-in kloons via embryonale stamcellen, rederivatie van niet-SPF muizen en cryopreservatie van belangrijke muizenlijnen. Op het einde van 2007 werden alle activiteiten van de TgSF gestopt.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Van Broeckhoven Christine
• Co-promotor: Merregaert Joseph
• Co-promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Specifieke doelstellingen van het project : 1) Detectie van 'silent' Kv subeenheden in het hart en hun rol bij de traag inactiverende 'delayer rectifier current' bestuderen; 2) Transgene analyse van de fysiologische rol van 'silent' subeenheden; 3) Is de interactie tussen Kv1.5 en KChIP een stabiele interactie en wat zijn de functionele gevolgen? 4) Wat zijn de moleculaire determinanten van de interactie tussen Kv1.5 en KChIP subeenheden ?

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Timmermans Jean-Pierre

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Spanningsgevoelige K+ kanalen komen algemeen voor in cellen. Een volledig geassembleerd K+ kanaal is een tetrameer van ¿-subeenheden. Op basis van homologie kunnen spanningsafhankelijke K+ kanalen onderverdeeld worden in verschillende (sub)families. De Kv familie telt 11 subfamilies. Alle tot nu toe gekende "silent" Kv subeenheden vormen functionele heterotetramere kanalen met de Kv2.x subeenheden waarbij ze de biofysische eigenschappen van Kv2 wijzigen. Met yeast-two-hybrid is ook een associatie van de silent Kv6.3, Kv10.1 en Kv11.1 subeenheden met Kv3.1 en Kv5.1 gevonden. Met behulp van elektrofysiologische experimenten zullen we nagaan of deze associaties functioneel aantoonbaar zijn in vivo. Hiernaast zal getracht worden dit moleculair te bevestigen met FRET en co-immunoprecipitatie experimenten. Kv2 subeenheden komen in nagenoeg alle neuronale weefsels voor, terwijl "silent" subeenheden een specifieker expressiepatroon vertonen. Door RT-PCR zal de expressie van "silent" Kv subeenheden in DRG neuronen bepaald worden. De rol van de geïdentificeerde "silent" Kv subeenheden op de elektrische eigenschappen van de DRG neuronen zal met behulp van de patch-clamp techniek nagegaan worden. Dit zal in eerste instantie gebeuren door biofysische parameters zoals kinetica en spanningsafhankelijkheid van de natieve Kv2 stromen te karakteriseren. In de "current clamp" mode zal de rol van de aanwezige silent Kv subeenheden in de actiepotentiaal en de afvuurfrequentie van de DRG neuronen nagegaan worden. Vervolgens zal de functie van de aanwezige "silent" Kv subeenheden bevestigd worden door overexpressie of RNAi. De functie van Kv6.3 zal op een complementaire manier nagegaan worden door een gedragsstudie op Kv6.3 overexpressie muizen uit te voeren en vervolgens de muis DRG neuronen te isoleren en een elektrofysiologische analyse, vergelijkbaar met deze op wild-type DRG neuronen, uit te voeren. Met dit project zal een beter inzicht verkregen worden in de associatie, distributie en fysiologische rol van "silent" Kv subeenheden. De functie van Kv6.3 zal op een complementaire manier nagegaan worden door een gedragsstudie op Kv6.3 overexpressie muizen uit te voeren en vervolgens de muis DRG neuronen te isoleren en een elektrofysiologische analyse, vergelijkbaar met deze op wild-type DRG neuronen, uit te voeren. Met dit project zal een beter inzicht verkregen worden in de associatie, distributie en fysiologische rol van "silent" Kv subeenheden.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Bocksteins Elke

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Spanningsgevoelige K+-kanalen (Kv) spelen een belangrijke rol in de exciteerbaarheid van neuronen. Een functioneel kanaal bestaat uit een tetrameer van ofwel indentieke -subeenheden (homototrameer) ofwel verschillende ¿-subeenheden (heterotetrameer). Hierdoor vormt heterotetramerisatie een potentieel belangrijke bron aan diversiteit van de natieve K-stromen. Bijgevolg is een gedetailleerde kennis van de ¿-subeenheid samenstelling van K+-kanalen noodzakelijk am een duidelijker beeld te krijgen van de natieve K-stromen en de rol van de verschillende ¿-subeenheden in vivo to kunnen begrijpen. In dit project zal met moleculaire en biochemische technieken worden nagegaan of er in vivo inderdaad heterotetramere K+-kanalen gevormd worden en zal de fysiologische rol van deze complexen onderzocht worden.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

In dit project zal de structuur en structuur-functierelatie onderzocht worden van: (i) het cardiale hERG PAS domein, (ii) de KChIP subeenheden die de werking van verschillende ionenkanalen beïnvloeden en (iii) globine gekoppelde sensoren waaraan een zuurstofsensing functie toegeschreven wordt. De analyses zullen gebeuren m.b.v. van geavanceerde elektronen paramagnetische resonantie technieken.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Van Doorslaer Sabine
• Co-promotor: Moens Luc
• Co-promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

• Biofysica en Biomedische Fysica

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Specifieke doelstellingen: 1)Welke kanaalregio's vormen het koppeling mechanisme tussen S4 en kanaalpoort ? 2)Bepaalt de kanaalpoort de conductantie van een kanaal? 3)Mechanisme van kanaalopening ophelderen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Torsade de pointes (Tdp), een van de meest gevreesde hartritmestoornissen wordt geassocieerd met QT prolongatie op het Ecg. Dit ziektebeeld dat reeds bekend staat als het lange QT syndroom kent in vele gevallen haar oorsprong in verworven en of congenitale stoomissen van myocardiale transmembranaire ionenkanalen waardoor actiepotentiaalduur (APD) verlenging ontstaat. Tot nog toe werden tenminste zes mutante loci (LQTl-6) geidentificeerd welke verantwoordelijk worden geacht voor het congenitale LQTS. Hoewel reeds vele farmaca met QT verlengende eigenschappen geidentificeerd werden, blijven vele oorzaken van de verworven variant nog onbekend. De achterliggende biofysische, celbiologische en farrnacologische mechanismen ter hoogte van de cardiale ionenkanalen die leiden tot QT verlenging blijven in vele gevallen nog onopgehelderd. Deze studie heeft tot doel de electrofysiologische karakteristieken en tevens de celbiologische processen noodzakelijk voor de functionele expressie van de LQT ionenkanalen te bestuderen, om zo nieuwe inzichten te verwerven in de ontstaansmechanismen van beide vormen (i.e verworven en congenitaal) LQTS. Daartoe worden Whole Cell Patch Clamp technieken al dan niet tijdens incubatie van mogelijke QT verlengende farmaca gebruikt. Verder wordt Confocale microscopie gebruikt om mogelijke traffickingstoomissen op te sporen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Raes Adam
• Co-promotor: Vrints Christiaan
• Mandaathouder: Saenen Johan

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Het N-terminale deel van het cardiale K+-kanaal hERG bevat een sequentie (AZ 1-90) die behoort tot de familie van de PAS-domeinen 12 (gekarakteriseerd op basis van homologie van de 3D structuur). Mutaties in dit domein veroorzaken het LOT syndroom, soms door verandering van de biofysische kanaaleigenschappen maar dikwijls door het feit dat de PAS mutatie belet dat het kanaal vanuit het endoplasmatisch reticulum (ER) naar de plasmamembraan getransporteerd wordt, zoals wij en anderen hebben aangetoond13-14. De lage expressie van de splice variant hERG- 1 b die dit PAS domein mist is consistent met de hypothese dat dit domein belangrijk is voor de trafficking. Sommige van deze mutaties vertonen een temperatuursafhankelijkheid wat doet vermoeden dat deze mutaties de 3D opvouwing van het PAS domein belnvloeden. De KChlP subeenheden werden geldentificeerd als cytoplasmatische 13-subeenheden 15. Deze groep is snel uitgebreid en recent hebben we een nieuwe splice variant van KChlP1 beschreven met unieke eigenschappen 16. Deze subeenheden associeren met de Kv4 familie van a-subeenheden waarbij de stroomdensiteit sterk verhoogd wordt (5 tot 10x). Dit betekent dat associatie van KChlP met een a-subeenheid een sterke invloed heeft op de trafficking van ionenkanalen en daardoor het expressieniveau mede bepaalt. Mogelijk is KChlP ook belangrijk voor de subcellulaire lokalisatie (vb dendriet, axon, cellichaam). Recente resultaten geven aan dat de KChlP familie ook associeert met Kv1.5 wat misschien een meer algemene rol van deze subeenheden doet veronderstellen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Van Doorslaer Sabine
• Co-promotor: Raes Adam
• Co-promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

• Biofysica en Biomedische Fysica

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

1.Analyse van genexpressie in atriaal en ventriculair weefsel van gezonde individuen en van patienten met atriale fibrillatie d.m.v. een DNA microarray. Recent werd deze chip voor de meeste relevante alfa- en beta-subeenheden uitgebreid. De resultaten van de patientenpopulatie worden vergeleken met deze van een controle populatie om die genen te identificeren waarvan de expressie gewijzigd is. 2.Testen van de progressieve verandering in expressieprofiel van ionenkanalen tijdens ontwikkeling van electrical remodelling in een experimenteel diermodel (tachycardie geinduceerde atriale fibrillatie bij de hond). 3.Correlatie van de geobserveerde verandering van genexpressie met veranderingen in de electrische eigenschappen van het weefsel (voltage clamp gegevens voor regionale verschillen, klinische gegevens voor de humane stalen, experimentele gegevens voor het diermodel).

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Boulet Inge

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Raes Adam

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project gebruikt de gecombineerde technische expertise van de drie onderzoeksgroepen om drie onderzoekstopics te bestuderen: het cerebellum, het enterisch zenuwstelsel en kaliumkanalen. Specifiek worden de indeling van neuronen in korrelcellaag, kaliumkanalen in Purkinje-cellen en hun inhibitie van de diepe kernen onderzocht, alsook expressie van kaliumkanalen in viscerosensorische neuronen en veranderingen ervan onder invloed van inflammatorische mediatoren vrijgesteld door mestcellen en de expressie en functie van 5 nieuwe subeenheden van kaliumkanalen in de hersenen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: De Schutter Erik
• Co-promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Timmermans Jean-Pierre

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Een algemeen kenmerk voor exciteerbare cellen is de aanwezigheid van ionenkanalen. Dit zijn integrale membraanproteïnen die de membraan permeabel kunnen maken voor ionen onder invloed van verschillende stimuli (bv. druk, ligand-binding, spanning). Op dit moment is reeds een waaier van genen gekend die coderen voor zulke ionenkanalen. Snel na de moleculaire klonering van de eerste kanalen werden proteïnen ontdekt die met de kanaal-subeenheden associëren en de werking ervan moduleerden. Deze modulerende eiwitten worden meestal ?-subeenheden genoemd, terwijl het oorspronkelijke porievormend gedeelte met de term ?-subeenheden wordt aangeduid. De beschikbare gegevens tonen aan dat vele ionenkanalen in vivo opgebouwd zijn uit zowel ?- als ?- subeenheden. De biofysische parameters van de natieve kanalen worden dan ook door beide subeenheden bepaald. Momenteel zijn verschillende subfamilies van ?- subeenheden gekend die interageren met spanningsgevoelige K+ kanalen. Hierbij kan een onderscheid gemaakt worden tussen cytoplasmatische en transmembraan subeenheden. Alle leden van de Kv?, KChIP en KChAP subfamilies zijn cytoplasmatische eiwitten. De subfamilie van de MinK en 'MinK-related-proteins' (MiRP's) daarentegen is gekarakteriseerd door één membraan-overspannend gedeelte met een intracellulaire carboxyterminus en een extracellulaire aminoterminus. De ?- subeenheden waarvan de fysiologische relevantie reeds bepaald is hebben uiteenlopende functies. De cytoplasmatische Kv ?- subeenheden werken bijvoorbeeld in op de trafficking van Kv1.x, Kv2.1 en Kv4.x subeenheden in een stabiele interactie waarbij de elektrofysiologische eigenschappen van de interagerende ?-subeenheden gewijzigd. Het, eveneens cytoplasmatisch, eiwit KChAP daarentegen wijzigt het proteïne level van zijn interactie partners in een transiënte associatie waarbij nooit een modulerend effect wordt waargenomen op de eigenschappen van de ?-subeenheden. Een modulerende functie is wel aanwezig bij de KChIP familieleden. Zij complexeren met de Kv 4 familieleden waardoor de expressie van Kv 4.2 en Kv 4.3 aan de membraan verhoogd wordt. Bovendien worden verschillende elektrofysiologische eigenschappen gewijzigd door de interactie van KChIP leden met de Kv4. Bij de transmembraan ?- subeenheden illustreert de interactie tussen KvLQT1 en MinK het belang van ?- subeenheden. Homotetramere KvLQT1 kanalen geven aanleiding tot een stroom die in het hart niet voorkomt. Heterologe expressie van KvLQT1 en MinK daarentegen geeft aanleiding tot een stroom met gelijke eigenschappen als de natieve IKs, stroom, aanwezig in hartweefsel. Mutaties in zowel KvLQT1 als MinK veroorzaken het long QT syndroom, een hartritmestoornis waarbij het QT interval van de EKG verlengd is De interactie van een ?-subeenheid kan dus in grote mate de expressie en/of de functionele eigenschappen van ?-subeenheden veranderen. De karakterisatie van de juiste interactiepartner van ?- en ?-subeenheden is van vitaal belang om de in vivo situatie beter te kunnen evalueren.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Raes Adam
• Mandaathouder: Van Hoorick Diane

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Torsade de pointes (Tdp), een van de meest gevreesde hartritmestoornissen wordt geassocieerd met QT prolongatie op het Ecg. Dit ziektebeeld dat reeds bekend staat als het lange QT syndroom kent in vele gevallen haar oorsprong in verworven en of congenitale stoomissen van myocardiale transmembranaire ionenkanalen waardoor actiepotentiaalduur (APD) verlenging ontstaat. Tot nog toe werden tenminste zes mutante loci (LQTl-6) geidentificeerd welke verantwoordelijk worden geacht voor het congenitale LQTS. Hoewel reeds vele farmaca met QT verlengende eigenschappen geidentificeerd werden, blijven vele oorzaken van de verworven variant nog onbekend. De achterliggende biofysische, celbiologische en farrnacologische mechanismen ter hoogte van de cardiale ionenkanalen die leiden tot QT verlenging blijven in vele gevallen nog onopgehelderd. Deze studie heeft tot doel de electrofysiologische karakteristieken en tevens de celbiologische processen noodzakelijk voor de functionele expressie van de LQT ionenkanalen te bestuderen, om zo nieuwe inzichten te verwerven in de ontstaansmechanismen van beide vormen (i.e verworven en congenitaal) LQTS. Daartoe worden Whole Cell Patch Clamp technieken al dan niet tijdens incubatie van mogelijke QT verlengende farmaca gebruikt. Verder wordt Confocale microscopie gebruikt om mogelijke traffickingstoomissen op te sporen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Raes Adam
• Co-promotor: Vrints Christiaan
• Mandaathouder: Saenen Johan

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

1.Analyse van genexpressie in atriaal en ventriculair weefsel van gezonde individuen en van patienten met atriale fibrillatie d.m.v. een DNA microarray. Recent werd deze chip voor de meeste relevante alfa- en beta-subeenheden uitgebreid. De resultaten van de patientenpopulatie worden vergeleken met deze van een controle populatie om die genen te identificeren waarvan de expressie gewijzigd is. 2.Testen van de progressieve verandering in expressieprofiel van ionenkanalen tijdens ontwikkeling van electrical remodelling in een experimenteel diermodel (tachycardie geinduceerde atriale fibrillatie bij de hond). 3.Correlatie van de geobserveerde verandering van genexpressie met veranderingen in de electrische eigenschappen van het weefsel (voltage clamp gegevens voor regionale verschillen, klinische gegevens voor de humane stalen, experimentele gegevens voor het diermodel).

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Boulet Inge

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Bij spanningsafhankelijk ionenkanalen wordt door de beweging van S4 (spanningssensor) een soort poort in de kanaalporie geopend (of gesloten). De grote verscheidenheid aan spanningsafhankelijke stroomactivatie is waarschijnlijk te wijten aan een onderlinge variatie in het `gating' mechanisme. De doelstelling van dit project is een beter inzicht te verkrijgen in het `gating' mechanisme, meer bepaald in het verbindingsmechanisme (link) tussen de beweging van de spanningssensor (S4) en de moleculaire conformatie die leidt tot het openen en/of sluiten van het kanaal. Hierbij worden twee types van potentiaalgeactiveerde kanalen onderzocht nl. Shaker en HCN, die een gelijkaardige algemene structuur vertonen maar sterk verschillend activeren. In beide typen wordt het gebied van S4 tot en met S6 als kandidaat-domein voor het verbindingsmechanisme geviseerd. Het verschil in `gating' mechanisme zal vnl. gekwantificeerd worden aan de hand van de elektrofysiologische parameters van de ionenstroom in combinatie met chimere kanalen, site directed mutagenese, cysteïne scanning (SCAM) en site directed fluorescentie. Voor deze studie wordt vnl. hKv1.5 als Shaker type, en HCN1 als HCN kloon gebruikt.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit netwerk voorstel heeft als hoofd thema de Moleculaire genetica en celbiologie van erfelijke ziekten bij de mens. Dit netwerk verenigt 11 excellente onderzoeksgroepen werkzaarn op de Universiteit Antwerpen rond moleculaire genetica vam ziekten zoals Alzheimer dementia, psychiatrische ziekten, mentale retardatie, perifere neuropathieen, doofheid en botziekten. Het beschikbaar komen van de mens genoom sequentie vooziet niet alleen moleculaire genetici in een aantal nieuwe instrumenten (bv. Bio-informatica, SNPs, etc.), die hun werk versnellen, maar veroorzaakt ook een verschuiving naar functionele analyses van de respectievelijke ziektegenen. De post genoom era vereist dan ook de integratie van 'high-throughput' analyse technieken en bio-informatica, maar eveneens het samengaan met excellente celbiologie groepen in het netwerk werkzaam op andere Belgische universtiteiten.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Van Broeckhoven Christine
• Co-promotor: De Jonghe Peter
• Co-promotor: Merregaert Joseph
• Co-promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Timmerman Vincent

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

In de draft versie van het humane genoom hebben we drie nieuwe K+-kanaal sequenties geidentificeerd, Ze zijn gelokaliseerd op chromosoom 2, 9 en 16 en bestaan uit tenminste 2 exonen. Door gebruik te maken van bestaande EST's en PCR amplificatie op verschillende cDNA banken hebben we de volledige lengte van elke kloon bekomen. Deze nieuwe kloons bezitten de volledige signatuur van een typisch K+-kanaal (S1-S6, P-regio en het GYG motief) maar ontbreken enkele geconserveerde residuen in de S6 regio typisch voor de `functionele' Kv1 tot 4 families. Zij gelijken dus sterker op de Kv5 tot 9 families. Nauwkeurige vergelijking van de sequenties toonde aan dat de sequentie op chromosoom 16 een nieuwe Kv6 sequentie is (Kv6.3, vertoond 55% identieke residuen met Kv6.1 en Kv6.2). De 2 andere sequenties vertonen ongeveer 35% identieke residuen met Kv2, Kv8 en Kv9. Vermits dit onvoldoende is om deze toe te wijzen aan de bestaande families worden ze aangeduid met Kv10.1 en Kv11.1. Heterologe expressie van deze subeenheden in Ltk- of in HEK293 cellen leverde tot nu toe geen functionele stroom op zoals verwacht vanuit de sequenties. De algemene doelstelling van dit project is de moleculaire en functionele eigenschappen van deze nieuwe, in het humane genoom geidentificeerde, subeenheden na te gaan. De algemene strategie van dit project bestaat uit een moleculair biologisch luik om het expressieprofiel te bepalen en interagerende partners te identificeren en een electrofysiologsich en microscopisch luik om de structuur functie relatie te achterhalen.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Een algemeen kenmerk voor exciteerbare cellen is de aanwezigheid van ionenkanalen. Dit zijn integrale membraanproteïnen die de membraan permeabel kunnen maken voor ionen onder invloed van verschillende stimuli (bv. druk, ligand-binding, spanning). Op dit moment is reeds een waaier van genen gekend die coderen voor zulke ionenkanalen. Snel na de moleculaire klonering van de eerste kanalen werden proteïnen ontdekt die met de kanaal-subeenheden associëren en de werking ervan moduleerden. Deze modulerende eiwitten worden meestal ?-subeenheden genoemd, terwijl het oorspronkelijke porievormend gedeelte met de term ?-subeenheden wordt aangeduid. De beschikbare gegevens tonen aan dat vele ionenkanalen in vivo opgebouwd zijn uit zowel ?- als ?- subeenheden. De biofysische parameters van de natieve kanalen worden dan ook door beide subeenheden bepaald. Momenteel zijn verschillende subfamilies van ?- subeenheden gekend die interageren met spanningsgevoelige K+ kanalen. Hierbij kan een onderscheid gemaakt worden tussen cytoplasmatische en transmembraan subeenheden. Alle leden van de Kv?, KChIP en KChAP subfamilies zijn cytoplasmatische eiwitten. De subfamilie van de MinK en 'MinK-related-proteins' (MiRP's) daarentegen is gekarakteriseerd door één membraan-overspannend gedeelte met een intracellulaire carboxyterminus en een extracellulaire aminoterminus. De ?- subeenheden waarvan de fysiologische relevantie reeds bepaald is hebben uiteenlopende functies. De cytoplasmatische Kv ?- subeenheden werken bijvoorbeeld in op de trafficking van Kv1.x, Kv2.1 en Kv4.x subeenheden in een stabiele interactie waarbij de elektrofysiologische eigenschappen van de interagerende ?-subeenheden gewijzigd. Het, eveneens cytoplasmatisch, eiwit KChAP daarentegen wijzigt het proteïne level van zijn interactie partners in een transiënte associatie waarbij nooit een modulerend effect wordt waargenomen op de eigenschappen van de ?-subeenheden. Een modulerende functie is wel aanwezig bij de KChIP familieleden. Zij complexeren met de Kv 4 familieleden waardoor de expressie van Kv 4.2 en Kv 4.3 aan de membraan verhoogd wordt. Bovendien worden verschillende elektrofysiologische eigenschappen gewijzigd door de interactie van KChIP leden met de Kv4. Bij de transmembraan ?- subeenheden illustreert de interactie tussen KvLQT1 en MinK het belang van ?- subeenheden. Homotetramere KvLQT1 kanalen geven aanleiding tot een stroom die in het hart niet voorkomt. Heterologe expressie van KvLQT1 en MinK daarentegen geeft aanleiding tot een stroom met gelijke eigenschappen als de natieve IKs, stroom, aanwezig in hartweefsel. Mutaties in zowel KvLQT1 als MinK veroorzaken het long QT syndroom, een hartritmestoornis waarbij het QT interval van de EKG verlengd is De interactie van een ?-subeenheid kan dus in grote mate de expressie en/of de functionele eigenschappen van ?-subeenheden veranderen. De karakterisatie van de juiste interactiepartner van ?- en ?-subeenheden is van vitaal belang om de in vivo situatie beter te kunnen evalueren.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Raes Adam
• Mandaathouder: Van Hoorick Diane

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Testen of het S4-segment een uitwaarts bewegende voltage sensor is en hoe deze kanaalopening veroorzaakt bij hyperpolarisatie. Het is onze hypothese dat de fysische beweging van S4 in HCN-kanalen gelijkaardig is als in K+-kanalen maar dat de verbinding met het openen van de porie verschillend is. Om de fysische beweging van-S4 na to gaan, maken we gebruik van de cysteine scanning mutagenese. Daarvoor zullen we S4-residuen naar cysteines muteren en bepalen welke toegankelijk zijn in de geopende en/of gesloten toestand van het kanaal, dit als test voor de `exposure upon activation' hypothese. Membraan-impermeabele cysteine modificerende reagentia (MTS) worden met een snel perfusiesysteem toegediend aan inside-out patches of in de whole-cell configuratie, zowel v66r de depolarisatie als gedurende de depolariserende pulsen. De exacte timing en snelle toediening (msec precisie) van reagentia is van cruciaal belang. Dit wordt bekomen door een snel perfusie systeem (Burleigh LSS-3200) onder de directe controle van het potentiaalklemmings en data acquisitie systeem. Deze methode levert rechtstreekse informatie op over de orientatie en de fysische beweging van het S4 segment. Wanneer deze aanpak bewijst dat S4 uitwaarts beweegt, zullen we in een volgende stap de oorzaak van het verschil in koppeling tussen de S4 beweging en opening van de porie nagaan. Hiertoe zullen we eerst chimere constructen maken door uitwisseling van S4 en/of S5-P-S6 tussen HCN en Kv1.5. In een complementaire aanpak zal de 'state'-afhankelijke toegankelijkheid van S6 zowel voor wild-type als voor gemuteerde HCN kanalen bepaald worden d.m.v. de cysteine scanning mutagenese methode (zie hoger).

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

In dit project wordt met een bestaande humane DNA microarray (HuGem 1, VIB) de veranderde genexpressie nagegaan bij 'electrical remodelling' als oorzaak van atriale fibrillatie. Tevens wordt een specifieke DNA microarrayaangemaakt om de expressie van ionenkanalen na te gaan bij de mens en de hond. Deze strategie zal dan ook toegepast worden op een model voor atriale fibrillatie bij de hond.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Bij spanningsafhankelijk ionenkanalen wordt door de beweging van S4 (spanningssensor) een soort poort in de kanaalporie geopend (of gesloten). De grote verscheidenheid aan spanningsafhankelijke stroomactivatie is waarschijnlijk te wijten aan een onderlinge variatie in het `gating' mechanisme. De doelstelling van dit project is een beter inzicht te verkrijgen in het `gating' mechanisme, meer bepaald in het verbindingsmechanisme (link) tussen de beweging van de spanningssensor (S4) en de moleculaire conformatie die leidt tot het openen en/of sluiten van het kanaal. Hierbij worden twee types van potentiaalgeactiveerde kanalen onderzocht nl. Shaker en HCN, die een gelijkaardige algemene structuur vertonen maar sterk verschillend activeren. In beide typen wordt het gebied van S4 tot en met S6 als kandidaat-domein voor het verbindingsmechanisme geviseerd. Het verschil in `gating' mechanisme zal vnl. gekwantificeerd worden aan de hand van de elektrofysiologische parameters van de ionenstroom in combinatie met chimere kanalen, site directed mutagenese, cysteïne scanning (SCAM) en site directed fluorescentie. Voor deze studie wordt vnl. hKv1.5 als Shaker type, en HCN1 als HCN kloon gebruikt.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Het voorgestelde project heeft als doel binnen een wetenschappelijk kontekst een centrale transgene eenheid op te richten binnen de Universiteit Antwerpen. Deze eenheid staat in voor de aanmaak van transgene en knock-out diermodellen,weefsels en cellen. De transgene technologie zal worden toegepast voor de functionele studie van : Genen betrokken bij de osteo/chondrogene differentiatie (Ecm1,Itm2a); Genen betrokken bij de pathogenese van affectieve stoornissen; Genen koderend voor K+ ion kanaaleiwitten .

Onderzoeker(s)

• Promotor: Merregaert Joseph
• Co-promotor: Snyders Dirk
• Co-promotor: Van Broeckhoven Christine

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

De ritmische activiteit van het hart vindt haar oorsprong in de sinusknoop. Pacemaker cellen vertonen een trage diastolysche depolarisatie die in grote mate gecontroleerd wordt door een gemengde Na/K-stroom. In tegenstelling tot de meeste potentiaal-geactiveerde kanalen, activeert deze stroom bij hyperpolarisatie. Vandaar zijn naam If (f voor "funny") of Ih (voor "hyperpolarizatie geactiveerd"). Er zijn reeds enkele subunits gekloneerd voor deze 'Hyperpolarization & Cyclic Nucleotide gated' (HCN) kanalen. De moleculaire structuur vertoont opvallende gelijkenis met deze van voltage-gated K kanalen welke openen bij depolarizatie. De specifieke doelstellingen zijn: (1) Cloneren van nieuwe isovormen van de HCN-familie en testen voor het bestaan van alternatieve splice varianten en geassocieerde beta-subunits; (2) Testen of het GYG-motief in de porie kritisch is voor de selectiviteit en de permeatie-eigenschappen van HCN-kanalen; (3) Testen of het S4-segment een uitwaarts bewegende voltage sensor is en hoe deze kanaalopening veroorzaakt bij hyperpolarizatie.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Bij spanningsafhankelijk ionenkanalen wordt door de beweging van S4 (spanningssensor) een soort poort in de kanaalporie geopend (of gesloten). De grote verscheidenheid aan spanningsafhankelijke stroomactivatie is waarschijnlijk te wijten aan een onderlinge variatie in het `gating' mechanisme. De doelstelling van dit project is een beter inzicht te verkrijgen in het `gating' mechanisme, meer bepaald in het verbindingsmechanisme (link) tussen de beweging van de spanningssensor (S4) en de moleculaire conformatie die leidt tot het openen en/of sluiten van het kanaal. Hierbij worden twee types van potentiaalgeactiveerde kanalen onderzocht nl. Shaker en HCN, die een gelijkaardige algemene structuur vertonen maar sterk verschillend activeren. In beide typen wordt het gebied van S4 tot en met S6 als kandidaat-domein voor het verbindingsmechanisme geviseerd. Het verschil in `gating' mechanisme zal vnl. gekwantificeerd worden aan de hand van de elektrofysiologische parameters van de ionenstroom in combinatie met chimere kanalen, site directed mutagenese, cysteïne scanning (SCAM) en site directed fluorescentie. Voor deze studie wordt vnl. hKv1.5 als Shaker type, en HCN1 als HCN kloon gebruikt.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk
• Mandaathouder: Labro Alain

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Bij spanningsafhankelijk ionenkanalen wordt door de beweging van S4 (spanningssensor) een soort poort in de kanaalporie (S6) geopend (of gesloten). De porie is tevens de bindingsplaats voor verscheidene farmaca. De doelstellingen van dit project zijn (1) testen in hoeverre S6 residues welke deel uit maken van de porie-wand betrokken zijn bij kanaalblokkering en opening van de 'gate'; (2) testen voor moleculaire determinanten van kanaal blokkerende versus agonistische actie van vetzuren en antiaritmica; (3) evaluatie in hoeverre stabiele cellijnen welke specieke subunits exprimeren bruikbaar zijn voor 'high-througput screening' van antiaritmica en voor het opsporen van pro-aritmische neveneffecten van andere farmaca (bv. antihistaminica). Voor deze studies wordt biofysiche analyze van kanaaleigenschappen d.m.v. patch clamp technieken gecombineerd met moleculaire manipulatie van de kanaalstructuur d.m.v. chimere kanalen, site directed mutagenese, cysteïne scanning en site directed fluorescentie. De specieke klonen gebruikt in dit onderzoek (hKv1.5, Kv4.2, HERG en KvLQT1) maken deel uit van de verschillende repolarizarende kalium stormen in het hart.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Dit project kadert in het algemene onderzoek van het laboratorium omtrent de moleculaire basis van de exciteerbaarheid van het hart. In dit project zal het researchteam onderzoeken welke de moleculaire determinanten zijn van blokkade van spannings-gevoelige kanalen door antiaritmica en locale anestetica. Spannings-gevoelige K+ kanalen spelen een cruciale rol in de controle van de cardiale exciteerbaarheid en repolarizatie en vormen het moleculaire aangrijpingspunt voor verscheidene nieuwere antiaritmica. Het team zal gecloneerde subunits gebruiken welke coderen voor de verscheidene cardiale kaliumstromen (Kv1.5, Kv4.2, HERG, KvLQT1). Steeds meer gegevens wijzen er op dat de moleculaire architektuur van de natieve kanalen ook geassocieerde proteinen (?-subunits) omvat welke de functie en mogelijk de farmacologie wijzigen. In dit project wordt enerzijds de hypothese getest dat specifieke aminozuren van het S6 segment bepalend zijn voor de binding van farmaca welke open kanalen blokkeren. Verder wordt getest hoe belangrijk hydrofobe interacties zijn voor de affiniteit en de stereoselectivieit van kanaal blokkade. Ook wordt nagegaan of verschillen in aminozuur samenstelling een uitleg vormt voor de isovorm- specifieke verschillen in affiniteit voor deze farmaca. Daarenboven zal getest worden of ?-subunits en kanaalblokkerende farmaca overlappende bindingsplaatsen hebben in de inwendinge monding van het kanaal en zal getest wroden of the intrinsieke farmacologie van KvLQT1 kanalen gewijzigd wordt wanneer KvLQT1 co-assembleert met minK (en aldus IKs vormt). Het team zal voor deze studies gebruik maken van de recentste technieken in de moleculaire biologie om de kanaalstruktuur te wijzigen, gecombineerd met 'state-of-the-art' patch clamp technieken voor functionele analyse van de kanalen. De resultaten zullen worden geinterpreteerd aan de hand van wiskundige en thermodynamische modellen voor gating en blokkade van deze kanalen. De studies zullen verder inzicht verschaffen in de moleculaire determinanten voor kanaal blokkade door antiaritmica, en over eventuele interacties met de structuren ('gates') verantwoordelijk voor opening en inactivatie van deze kanalen. De resulterende informatie zal bijdragen tot een dieper inzicht in de moleculaire farmacologie van deze belangrijke kanalen, wat kan leiden tot een beter inzicht in mechanismen van aritmien en uiteindelijk zal bijdragen tot de ontwikkeling van betere antiaritmische therapie.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Snyders Dirk

Onderzoeksgroep(en)

Project type(s)

• Onderzoeksproject