Onderzoek Sébastjen Schoenaers

Abstract

Als resultaat van individuele celgroei, groeien planten naar omgevingen die gunstig zijn voor hun overleving. Celgroei is enkel mogelijk als de celwand, die plantencellen omringt, niet te rigide, noch te zwak is. De samenstelling van de celwand moet dus gecontroleerd worden. Hoe cellen celwandbiomechanica controleren tijdens celgroei is het centrale thema van dit project. Planten hebben eiwitten ontwikkeld om de celwand te monitoren. Verschillende leden van de 'Catharanthus roseus Receptor-like kinase 1-like' (CrRLK1L) eiwitfamilie functioneren als celwand compositie-sensoren tijdens celgroei. In Arabidopsis thaliana hebben wij het CrRLK1L ERULUS (ERU) geïdentificeerd, een eiwit dat celwand compositie en pectine (een celwand component dat flexibiliteit controleert) dynamieken controleert tijdens wortelhaargroei. ERU werkt klaarblijkelijk samen met een ander CrRLK1L genaamd FERONIA (FER). Om te begrijpen hoe celwandbiomechanica gecontroleerd word tijdens celgroei zullen we (1) de relatie tussen pectine modificatie en wortelhaargroei, (2) de celwand eigenschappen van ERU en FER mutanten, (3) de signalen die waargenomen worden door ERU en (4) de functionele relatie tussen celwand pH, pectine, RALF (celwand gelokaliseerde peptiden), Ca2+, ERU en FER signalisatie in celgroei bestuderen. Onze resultaten zullen een geïntegreerde visie bieden op de processen die celwandbiomechanica controleren tijdens celgroei, met ERU en FER wortelhaargroei als model.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Vissenberg Kris
• Mandaathouder: Schoenaers Sébastjen

Onderzoeksgroep(en)

• Geïntegreerd Moleculair Plantenfysiologisch Onderzoek (IMPRES)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Plantencelgroei is afhankelijk van het gecontroleerd lossen/verstevigen van de celwand, hetgeen resulteert in een matrix die niet te rigide, noch te zwak is. Planten hebben celwand-bindende receptor eiwitten ontwikkeld om de celwand samenstelling te monitoren en controleren. De Catharanthus roseus Receptor-like Kinase 1-like (CrRLK1L) familie van planteneiwitten heeft hierbij veel aandacht gekregen. Verschillende CrRLK1L eiwitten controleren celgroei door het monitoren van de celwand status tijdens expansie. Desalniettemin blijven de mechanismen die aan de basis liggen van CrRLK1L signalisatie slecht begrepen. Met als doel het verder karakteriseren van CrRLK1L signalisatie identificeerden we ERULUS (ERU), een belangrijke regulator van wortelhaarcel elongatie en een putatieve sensor van celwand rigiditeit. ERU knock-out wortelharen zijn kort en gezwollen, en vertonen drastische defecten in de compositie van de celwand, en pectine (een celwand polysacharide) modificatie en dynamieken. De mate van pectine methylesterificatie is direct gerelateerd aan de mate van celwand rigiditeit. Aldus moeten pectine modificaties continu gemonitord en bijgestuurd worden om celgroei aan te houden. Het ERU extracellulaire domein gelijkt sterk op dat van de CrRLK1Ls BUDDHAS PAPER SEAL ½ (BUPS1/2), dewelke pectine binding in vitro. Daarenboven verloopt ERU-gecontroleerde wortelhaargroei via het CrRLK1L FERONIA (FER), dewelke ook pectine bindt. Samen bieden deze data een sterke basis voor een directe ERU-celwand interactie. Hier stellen we voor om een breedspectrum glycoarray te gebruiken om te screenen voor ERU-specifieke celwand liganden. Deze methode is reeds gebruikt voor het identificeren/karakteriseren van antilichaam specificiteit, koolhydraat-bindende modules en celwand modificerende enzymen. De procedure bestaat uit het kloneren en heteroloog tot expressie brengen van een His6- en GST-geconjugeerd ERU extracellulair domein, en vervolgens de array analyse met het bacteriële extract dat het oplosbare recombinante eiwit bevat. Het protocol omvat weinig risico's, is simpel en betaalbaar (vergt geen eiwit opschaling en zuivering). Daarenboven kan het geconjugeerde eiwit construct ingezet worden voor een verscheidenheid aan andere applicaties die als doel hebben het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-celwand interacties. Dit experiment zal uitgevoerd worden gedurende een twee maand durende onderzoekverblijf, en zal belangrijke expertise binnenbrengen in de IMPRES onderzoeksgroep. Daarnaast is het resultaat van dit experiment instrumenteel voor ons lopende onderzoek en cruciaal voor het beter begrijpen van celwand monitoring tijdens plantencelgroei.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Schoenaers Sébastjen

Onderzoeksgroep(en)

• Geïntegreerd Moleculair Plantenfysiologisch Onderzoek (IMPRES)

Project type(s)

• Onderzoeksproject

Abstract

Twee kinases en 1 kinase-interagerend eiwit werden geïdentificeerd met 2 microarray datasets van wortelhaarmutanten gekoppeld aan een comprehensieve 'reverse genetics' aanpak. Het project beoogt na te gaan hoe deze genen gereguleerd worden door auxine en hoe ze wortelhaargroei reguleren. Dit kan samengevat worden door verschillende objectieven: 1) De genen worden door auxine gereguleerd op een auxine respons factor-afhankelijke wijze (ARF7/ARF19). Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) gevolgd door gen-specifieke PCRs zal aantonen of de genen directe dan wel indirecte doelwitten zijn van de ARFs (Dr. Hill, Nottingham Univ.) en qPCR zal hun expressieniveaus in verschillende auxine signalisatiemutanten verduidelijken, hetgeen de regulatie door auxine verder opheldert. 2) De bijdrage van de genen in de NADPH-oxidase afhankelijke, auxine-gereguleerde ROS accumulatie in wortelharen zal bestudeerd worden via moleculair biologische technieken en verschillende vormen van microscopie. 3) Met ionen-specifieke vibrerende probes en ion-sensitieve kleurstoffen gekoppeld aan ratio-visualisatie wordt het effect van de knock-outs op de extracellulare ionen-fluxen en de intracellulaire ionen-gradiënten aan de wortelhaartips - een conditio sine qua non voor wortelhaargroei - gekwantificeerd (Prof. Feijó, Lisbon Univ.). 4) De interactiepartners/doelwitten van de verschillende eiwitten worden geïdentificeerd via tandem affiniteits opzuivering (TAP; Dr. De Jaeger, Gent), gevolgd door kinase testen. T-DNA insertie-lijnen voor de geïdentificeerde interactiepartners worden gescreened op wortelhaar (en pollenbuisgroei) fenotypes. Samen verduidelijken deze objectieven hoe auxine deze genen reguleert en hoe de genen op hun beurt de tipgroei in wortelharen (en pollenbuizen) stuurt en beïnvloedt.

Onderzoeker(s)

• Promotor: Vissenberg Kris
• Mandaathouder: Schoenaers Sébastjen

Onderzoeksgroep(en)

• Geïntegreerd Moleculair Plantenfysiologisch Onderzoek (IMPRES)

Project type(s)

• Onderzoeksproject